Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro và in vivo giống hoa Loa kèn màu mói nhập nội

xác định hệ số nhân của quá trình nhân giống in vitro. Môi trường nuôi cấy nhân tạo có các chất điều tiết sinh trưởng như: Auxin, Cytokinin, đồng thời phải chú ý đảm bảo những điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, quang chu kỳ... + Giai đoạn 5: Tạo cây hoàn chỉnh Là giai đoạn chuyển những chồi đã hình thành trong giai đoạn nhân nhanh sang môi trường tạo rễ để hình thành cây có đủ rễ, thân, lá, đủ tiêu chuẩn là cây giống. Môi trường tạo rễ thường bổ xung auxin để kích thích hình thành rễ. + Giai đoạn 6: Đưa cây in vitro ra đất Đây là bước quyết định để đánh giá thực tiễn của quy trình nhân giống in vitro. Nên các loại giá thể trồng cây in vitro phải đảm bảo độ sạch vi khuẩn, xốp và thoáng khí giúp cây con đạt tỷ lệ sống cao. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào có một số ưu điểm đó là có hệ số nhân giống rất cao, nhân nhanh được các giống cây sạch bệnh, đa dạng hoá nguồn gen, đáp ứng được nhu cầu thưởng thức của người tiêu dùng. 2.3.22. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giôhg: * Môi trường nuôi cấy: Là yếu tố quyết định cho sự sinh trưởng, phát triển của mô trong nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy bao gồm một số thành phần cơ bản sau: + Các nguyên tố đa lượng: Gồm N, p, K, s, Mg, Ca. Chúng có chức năng là nguyên liệu để xây dựng nên các thành phần cấu trúc của mô tế bào và mô thực vật. Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng phải > 30 mg/1 mặc dù tỷ lệ giữa các nguyên tố này có thể biến đổi. + Các nguyên tố khoáng vi lượng: Bao gồm Fe, Bo, Mn, I, Mo, Cu, Zn. Chúng tham gia vào thành phần của các enzim xúc tác cho phản ứng hoá sinh diễn ra trong tế bào. Hàm lượng các yếu tố vi lượng thường < 30 mg/1. + Nguồn cacbon hữu cơ: Trong nuôi cấy mô, cây sinh trưởng, phát triển được nhờ sự kết hợp cả 2 phương thức: Dị dưỡng và tự dưỡng. Chính vì vậy, bổ xung nguồn cacbon hữu cơ vào môi trường là cần thiết. Nguồn cacbon hữu cơ thường sử dụng là đường saccaroza 2 -T- 3%. + Các vitamin: Các mô tế bào khi nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng tổng hợp vitamin nhưng lượng đó không đủ để cung cấp cho hoạt động sống của cây do đó phải bổ xung các vitamin vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng thích hợp. Thường bổ xung các vitamin nhóm B như: Bl, B2, B3, B5, B6. + Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật: Là các chất đảm bảo cho việc điều khiển sự phân hoá và phản phân hoá trong nuôi cấy in vitro, thường sử dụng 2 nhóm Auxin và Cytokinin. + Các hợp chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch nghiền của khoai tây, chuối được bổ xung vào môi trường nhằm làm tăng cường thêm các axit amin, vitamin cũng như nhiều yếu tố dinh dưỡng khác. + Agar: Là chất làm đông cứng môi trường tạo điều kiện cho mẫu cấy sinh trưởng, phát triển tốt. + PH môi trường: PH thích hợp cho phần lớn các mô nuôi cấy là 5,5 - 5,8. 2.3.23. Cơ sở sinh lý của các biện pháp nhân giống ỉn vitro: Là tính toàn năng của tế bào thực vật thể hiện qua quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Mỗi tế bào của bất kì sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích họp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh gọi là tính toàn năng của tế bào. Sự phân hoá tế bào là sự chuyển từ các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau. Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá Sự phản phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào chuyên hoá trở lại dạng tế bào phôi sinh. Phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Tính toàn năng của tế bào được thể hiện qua quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào trong những điều kiện nhất định. Trong môi trường nuôi cấy mô, sự phối họp hàm lượng và tỷ lệ của các chất điều tiết sinh trưởng thuộc 2 nhóm Auxin và Cytokinin có tác dụng điều chỉnh quá trình phân hoá và phản phân hoá của mô nuôi cấy. 2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: 2.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước: Năm 1969, Gauthret nghiên cứu hàm lượng dinh dưỡng muối khoáng có vai trò trong sự sinh trưởng và phân chia tế bào khi nuôi cấy mô hoa Loa kèn. Năm 1980, Van Aartriík và Blom, đã tìm ra môi trường thích hợp cho nuôi cấy Loa kèn là môi trường MS có hàm lượng muối khoáng giảm một nửa sẽ cho khả năng tái sinh chồi cao. Khi nghiên cứu nguồn vật liệu nuôi cấy ban đầu Robb (1957) và Allen (1974) đã chỉ ra bộ phận nuôi cấy thích hợp nhất với cây Loa kèn là vẩy củ. Khi nuôi cấy vẩy củ đã rút ngắn thời gian tái sinh chồi và tỷ lệ tái sinh chồi luôn cao hơn các bộ phận khác. Năm 1993, Stanilova. M và Zagorska (Bungari) cũng khẳng định vẩy củ là nguyên liệu tốt nhất cho việc tái sinh chồi từ mô nuôi cấy trên môi trường Skoog có bổ xung 0,5 mg aNAA/1 và 0,1 mg Kinetin/1, tạo ra các cây giống đồng đều về chất lượng. Năm 1981, Van và Blom đã xác định được vai trò của aNAA trong sự tái sinh chồi. Ngoài ra còn có BA cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của chồi. Năm 2000, J. Suh và J. Lee đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và chất lượng ánh sáng đến sự hình thành củ Loa kèn con và cho thấy ở nhiệt độ 20 25°c, -T- số lượng, khối lượng và đường kính của củ con tăng hơn so với ở nhiệt độ 30°c, số lượng củ con cũng cao hơn khi ở dưới ánh sáng đỏ [15]. Các nghiên cứu về sự xuân hoá củ bằng nhiệt độ thấp cũng được J. Lee, Young A.Kim tiến hành và xác định được thời gian xử lý lạnh từ 4 tuần trở lên ở 5°c thì các củ nảy chồi và ra hoa sớm hơn, số lượng hoa cũng tăng lên [16]. 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước: Ở nước ta hiện nay, những nghiên cứu về nhân giống hoa Loa kèn trắng trong nước hay một số giống Loa kèn màu mới nhập nội chỉ mới tập trung vào biện pháp nhân giống in vitro chứ chưa tập trung đến các biện pháp nhân giống in vivo, vì vậy có rất ít nghiên cứu về biện pháp này. Nhân giống ngoài đồng ruộng in vivo chỉ được nhắc đến như là biện pháp nhân giống cổ truyền trong một số tài liệu giới thiệu về kĩ thuật trồng và chăm sóc hoa - cây cảnh trong đó có cây hoa Loa kèn [5]. Năm 1993, Mai Xuân Lương và cộng sự đã thăm dò quy trình nhân giống cây hoa Loa kèn trên môi trường đa lượng với các mức dinh dưỡng khác nhau như MS, White, Knop cho thấy tốt nhất vẫn là môi trường MS và bổ sung các nguyên tố vi lượng (Theo Heller), vitamin (Theo Morel), lOOmg inositol/1, 20g đường saccaroza và 15g Agar/1 [4], Năm 1994, Dương Tấn Nhựt đã công bố kết quả nghiên cứu giống hoa Loa kèn bằng phương pháp nuôi cấy vẩy củ. vẩy củ được khử trùng bằng HgCl 2 0,2% trong 5 phút, sau đó cấy lên môi trường MS có bổ sung các thành phần vitamin, chất hữu cơ và saccaroza. Sau khi tạo được cây con, có thể tiếp tục nhân bằng cách tách các vẩy củ đã được tạo thành đem cấy trên môi trường nhân [6]. Năm 1996, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Nhẫn, Nguyễn Phương Thảo đã nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên giống hoa Loa kèn tím mới nhập nội từ Pháp và đưa ra quy trình nhân giống kể từ khi đưa mẫu vào cho đến khi sản xuất ra củ giống [7]. Năm 2001, Dương Tấn Nhựt và cộng sự nghiên cứu nhân giống hoa Huệ tây sạch bệnh qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Đỉnh sinh trưởng được tách từ chồi đỉnh của củ Loa kèn, được khử trùng bằng HgCl 2 0,1% trong 7 phút sau đó cấy vào môi trường 1/2 MS. Sau khi tạo được cây hoàn chỉnh có thân chính phân đốt, tiến hành cắt thân chính thành nhiều đốt nhỏ để tiến hành nhân nhanh. Cũng trong năm 2001, Nguyễn Thị Nhẫn và Nguyễn Quang Thạch đã thành công trong nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tạo củ in vitro trong công tác nhân giống cây hoa Loa kèn [8]. PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DƯNG YÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứư 3.1. Đối tượng nghiên cứu: + Hai giống Loa kèn màu nhập nội từ Trung Quốc có màu tím - đỏ và màu vàng. + Nguyên liệu nuôi cấy ban đầu: vẩy củ loa kèn màu. + Nguyên liệu cho thí nghiệm tạo củ: Cây con được tái sinh từ vật liệu nuôi cấy ban đầu. + Nguyên liệu cho thí nghiệm ngoài vườn: Các cây có đủ số lá và số rễ trung bình trên cây. + Nguyên liệu cho thí nghiệm phá ngủ: Các củ vừa cho thu hoạch hoa. + Nguyên liệu cho thí nghiệm nhân giống từ củ mẹ: Những cây đã cho hoa nhưng vẫn tiếp tục trồng để hình thành củ con. + Nguyên liệu cho thí nghiệm nhân giống bằng củ con: Những củ con được hình thành từ củ mẹ.